ギ酸塩のオーバーフローは、MTHFD1 阻害がん細胞における有毒な葉酸塩の捕捉を促進する

Nature Metabolism volume 5、pages 642–659 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

がん細胞は、酵素メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ - シクロヒドロラーゼ 1 および 2 (MTHFD1 および MTHFD2) を含む一炭素 (1C) 代謝を上方制御することにより、ヌクレオチド供給の必要性を高めます。 TH9619 は、MTHFD1 と MTHFD2 の両方におけるデヒドロゲナーゼおよびシクロヒドロラーゼ活性の強力な阻害剤であり、がん細胞を選択的に殺します。 今回、細胞内ではTH9619が核のMTHFD2を標的とするが、ミトコンドリアのMTHFD2は阻害しないことを明らかにした。 したがって、ミトコンドリアからのギ酸塩のオーバーフローは、TH9619 の存在下で継続します。 TH9619 は、ミトコンドリアのギ酸放出の下流で発生する MTHFD1 の活性を阻害し、10-ホルミル-テトラヒドロ葉酸の蓄積を引き起こします。これを「葉酸トラップ」と呼びます。 これにより、チミジル酸が枯渇し、MTHFD2 発現がん細胞が死滅します。 このこれまで特徴づけられていなかった葉酸トラップ機構は、新たなプリン合成経路をブロックし、さらにプリン合成のための10-ホルミル-テトラヒドロ葉酸の消費を妨げる生理学的ヒポキサンチンレベルによって悪化します。 TH9619 についてここで説明した葉酸捕捉メカニズムは、他の MTHFD1/2 阻害剤や葉酸拮抗剤とは異なります。 したがって、我々の発見により、がんを攻撃するアプローチが明らかになり、1C 代謝の調節機構が明らかになりました。

1 炭素 (1C) 代謝は、DNA 合成と修復のためのヌクレオチドの供給の中心です。 増殖要求を満たすのに十分なヌクレオチドの供給がないと、細胞は複製ストレスとゲノム不安定性により細胞周期停止または細胞死を起こします1、2、3。 1C 代謝経路に関与する酵素は、一般的にがんにおいて上方制御され、急速な増殖に必要なヌクレオチドとアミノ酸を生成します 4、5、6。

1C 代謝は主に非必須アミノ酸セリンによって促進されます。セリンは解糖中間体 3-ホスホグリセリン酸から生成されるか、細胞外空間から供給されます 7。 ヌクレオチド合成には、葉酸依存性 1C 代謝によるセリンの異化が必要です。 これは、ミトコンドリアとサイトゾルで起こる 4 つの可逆的な酵素反応によって媒介されます (図 1a)。 セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ (SHMT) は、ヒドロキシメチル基をセリンからテトラヒドロ葉酸 (THF) に転移して、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸 (CH2-THF) とグリシンを生成します。 メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ - シクロヒドロラーゼ (MTHFD) は、CH2-THF を酸化して 10-ホルミル-テトラヒドロ葉酸 (10-CHO-THF) に加水分解し、その後ホルミル THF 合成酵素によって THF とギ酸に加水分解されます。 サイトゾルでは、これらの反応は SHMT1 と、デヒドロゲナーゼ - シクロヒドロラーゼ (DC) ドメインとホルミル THF シンテターゼ (FS) ドメインという 2 つの異なるドメインを含む三機能性 MTHFD1 によって触媒されます。 ミトコンドリアでは、同じ反応が SHMT2、二機能性 MTHFD2 (DC 活性) および MTHFD1L (FS 活性) によって触媒されます (図 1a)8。 バリエーションは存在しますが9、この経路の標準的な方向性はセリン異化とミトコンドリアを介した1Cユニット酸化に従いますが、サイトゾル1Cユニットは高いサイトゾルNADPH:NADP+比によって駆動される還元（逆）経路をたどります8、10、11、12。 このようにして、1C 代謝はミトコンドリアと細胞質の間に広がるサイクルを形成します。 SHMT1 および MTHFD1 触媒反応の可逆性により、ミトコンドリア 1C 代謝の損失はサイトゾル経路を介して補うことができます 13。

a、1C ミトコンドリアとサイトゾル/核の間の代謝フラックス。 b〜e、50μMチミジン、1mMギ酸ナトリウムまたはビヒクルの存在下でTH9619（b）、TH9975（c）、DS18561882（d）またはSHIN1（e）で96時間処理したSW620細胞の用量反応曲線（ RPMI-FBS で培養）、平均±標準偏差（n = 3）。 f、示された濃度のTH9619およびTH9975または50nM MTX（RPMI-FBSで培養）で24時間処理したSW620 WT、MTHFD2-/-、およびSHMT1-/-細胞の[U-13C]セリン由来ギ酸塩放出速度、±sdを意味します（コントロールおよびTH9619の場合はn = 3、TH9975の場合はn = 2、MTXの場合はn = 1）。 Tukey の多重比較検定による一元配置 ANOVA (分散分析)。 g、1μMのTH9619またはTH9975または0.5μM MTXで48時間処理したSW620 WT細胞におけるミトコンドリア膜電位の定量。 FCCPを陽性対照として使用した。 データは平均値 ± SD (FCCP の場合は n = 4、n = 5) として表示されます。 多重比較のためのダネット検定を使用した一元配置分散分析。 h、i、10μM TH9619またはビヒクルで3時間処理したSW620 WT細胞におけるMTHFD2安定化のCETSA分析。 MTHFD2の安定化は、残りのMTHFD2シグナルをミトコンドリア画分(h)のHSP60または核画分(i)のラミンA/Cに対して正規化することによりウェスタンブロットによって評価した。 j、2つの独立した実験のうちの1つの代表的な免疫ブロット。 k、10μM TH9619またはビヒクルとともに30分間インキュベートし、その後プロナーゼ濃度を増加させてタンパク質消化し、ウェスタンブロットによるMTHFD1分解を評価したSW620ライセートにおけるMTHFD1安定化のDARTS分析。 MTHFD1 シグナルは SOD1 に正規化されました。 3 つの独立した実験のうちの代表的なものを示します。 l、MTHFD1(DC) WT または MTHFD1(DC) 変異体 (Q100A) に対する阻害活性について評価した、示された MTHFD1/2 阻害剤の平均 pIC50 (最大阻害濃度の半値の対数) 値、平均 (左から右へ n = 4、9、2、19、5、15、5、6、4、8）; 対応のない両側 t 検定。 m、MTHFD1-Q100A 用の CRISPR-Select カセットが SW620 細胞に送達されました。 グラフは、10 μM TH9619 治療の 2 日目および 25 日目の MTHFD1-Q100A 対 WT の比を 2 日目の値に正規化して示しています。平均値 ± SD (n = 4)。 対応のある両側 t 検定。