共生細菌綱内の系統によるプロパンの嫌気性酸化と硝酸塩還元の結合

Nature Communications volume 13、記事番号: 6115 (2022) この記事を引用

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23 オルトメトリック

メトリクスの詳細

嫌気性微生物は、陸上および水生生態系から大気への短鎖ガス状アルカン (SCGA; エタン、プロパン、ブタンを含む) のフラックスを制御する上で重要な役割を果たしていると考えられています。硫酸塩は、SCGA の微生物による嫌気性酸化をサポートする電子受容体として機能することが確認されていますが、他のいくつかのエネルギー的により好ましい受容体が嫌気性環境においてこれらのガスと共存します。今回我々は、廃水処理施設からのバイオマスを播種したバイオリアクターが、硝酸塩の二窒素ガスとアンモニウムへの還元と組み合わせた嫌気性プロパン酸化を実行できることを示す。バイオリアクターは 1000 日以上稼働し、13C および 15N 標識実験、メタゲノム分析、メタトランスクリプトーム分析、メタプロテオーム分析および代謝産物分析を使用して、微生物群集と代謝プロセスを特徴付けました。これらのデータは、観察された硝酸塩依存性プロパン酸化の原因は、細菌綱シンバイオバクテリア内で新しい順序を表す種であることを総合的に示唆しています。我々が「Candidatus Alkanivorans nitratireducens」と名付けたこの生物の閉鎖ゲノムは、フマル酸塩の添加によるプロパンのCO2への酸化と硝酸塩の還元の経路をコードしており、重要な遺伝子はすべて硝酸塩依存性のプロパン酸化中に発現する。我々の結果は、硝酸塩が嫌気性環境におけるSCGA酸化に関連する電子シンクであり、炭素と窒素の循環の間に微生物を介した新たなリンクを構成していることを示唆している。

かなりの量の天然ガスが、深海の堆積物や大陸縁辺および陸上生態系の炭化水素の浸出から生成されます1、2。放出された天然ガスのほとんどは、ガスが酸素環境や大気中に拡散する前に、無酸素地帯の微生物によって消費されます3、4、5。天然ガスの嫌気性酸化の研究は、最も豊富な成分（約 60 ～ 90%）として強力な温室効果ガスであるメタンに焦点を当ててきました6,7。しかし、エタン、プロパン、n-ブタン、イソブタンなどの短鎖ガス状アルカン (SCGA) も天然ガスの実質的な構成成分 (最大約 20%) であり 8、オゾンや有機エアロゾルの重要な前駆体です 9。 SCGA の大気排出量は、エタンで 9.2 ～ 9.6 Tg / 年、プロパンで 9.6 ～ 10.5 Tg / 年、ブタンで 10 Tg / 年、イソブタンで 4.2 Tg / 年と推定されています10。

メタンの嫌気性酸化 (AOM) は広く研究されており、比較的よく理解されています 7、11、12、13、14、15、16、17。嫌気性メタン栄養古細菌 (ANME) は、重要なメチル-CoM レダクターゼ (MCR) 複合体を含む逆メタン生成経路を介してメタンを酸化します。 ANME はメタンから共栄養性硫酸塩還元細菌 (SRB) 11,12 に電子を往復させたり、硝酸塩や金属酸化物の還元に直接電子を伝えたりします 13,14,15,16。細菌「カンジダトゥスメチロミラビリスオキシフェラ」は、亜硝酸塩を唯一の電子受容体として使用する「好気性内」メタン酸化経路を介して AOM を実行します17。微生物はまた、無酸素条件下での SCGA の酸化とこれらの電子受容体の還元を結びつける可能性があります 18。「Ca. M. oxyfera は、メタンモノオキシゲナーゼを介してエタンとプロパンを酸化できることが示されていますが、これらの炭素源が増殖をサポートするかどうかはまだ示されていません 19。現在まで、硫酸塩は、SCGA の嫌気性酸化をサポートすることが確認されている唯一の電子シンクです 20、21、22、23、24、25。デルタプロテオバクテリア分離株 Desulfosarcina aeriophaga BuS5 は、アルキル置換コハク酸塩を生成するフマル酸付加経路（アルキルコハク酸シンターゼ (ASS) 20,21 を介するプロセス）を介してプロパンとブタンを酸化し、硫酸塩を硫化物に直接還元します。古細菌「Candidatus Syntrophoarchaeum」を濃縮すると、分岐型MCRによって触媒されるプロセスであるブチルコエンザイムM形成を介してブタンが活性化され、還元等価物が共栄養性SRBパートナーに送られることが判明した23。同様に、嫌気性エタン酸化は、同様に MCR 様複合体をコードする関連する「Candidatus Argoarchaeum ethanivorans」と関連しており、SRB22 と共栄養関係を形成することが示唆されました。しかし、硫酸塩の還元と直接結合する嫌気性プロパン酸化を媒介できる古細菌はまだ特定されていない。

90% and >70% bootstrap values, respectively. The scale bars indicate amino acid substitutions per site. b A composite fluorescence micrograph of the enrichment culture hybridized with the SYMB-1018 FISH probe (Cy3, red; targeting ‘Ca. A. nitratireducens’) and stained with DAPI (blue; all microbial cells). ‘Ca. A. nitratireducens’ cells appear magenta (blue + red). The scale bar indicates 20 μm. The representative image was selected based on the visual assessment of six separate hybridisation experiments. Consistent results were also obtained independently with two additional probes targeting the ‘Ca. A. nitratireducens’ population (Supplementary Fig. 8). c, d Relative expression of each genome and unbinned contigs, and microbial metabolism of interest for the genomes in the bioreactor. The total transcripts per million (TPM) was calculated for each gene. Genome sets with overall expression of total TPM > 1% are shown (c). KEGG annotation was used to identify ORFs coding for denitrification (M00529) and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (M00530) pathways (d). Source data are provided as a Source Data file./p> 147.2) of the enriched culture extracts (n = 3, taken at various time points) revealed a peak at retention time 10.832 min, matching the peak of the iso-propylsuccinate standard. b A peak at retention time 11.078 min (ion transition, m/z: 289 > 147.1), corresponding to the peak from the propylsuccinate standard, was observed for cell extracts from the enriched culture (n = 3 at different sampling points). c Phylogenetic relationship of ‘Ca. A. nitratireducens’ AssA (Red) to other AssA and BssA in the NCBI database. Three AssA subunits (AssA123) found in ‘Ca. A. nitratireducens’ MAG formed a separate cluster. Bootstrap values >90% are shown as black dots on branch nodes. Scale bar represents amino acid substitutions per site./p> 147.2) and propylsuccinate (m/z: 289 > 147.1) standards were detected in the cell extracts (Fig. 4a, b). These findings support the hypothesis that ‘Ca. A. nitratireducens’ activates propane through homolytic C-H bond cleavage at both primary and secondary carbon atoms, and with addition of fumarate, yields propylsuccinate and iso-propylsuccinate. In addition, iso-propylsuccinate (5.96 nM) was more abundant than propylsuccinate (2.33 nM) in the culture extracts, suggesting the secondary carbon atom activation generating iso-propylsuccinate is the main route of propane oxidation (Fig. 5)./p> Q5. Among them, 12 million reads were longer than 1000 bp with read N50 of 6,135 bp. Adapters were trimmed using Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop)./p> 30 was selected and mapped to the KEGG Orthology database. The eggNOG v5 database was searched against using emapper 2.1.5 in diamond mode. Conserved motif(s) present within the predicted genes related to propane oxidation and nitrogen metabolism were further verified using NCBI’s conserved domain search62. Annotated KO numbers were used for inferring the pathway encoded in each genome. Pathways were identified as ‘not expressed’ if missed blocks > 75% when total blocks > 5, or missed blocks > 1 when total blocks ≤ 5./p>92% similarity), the probes were designed against the 16 S sequence of ‘Ca. A. nitratireducens’ and care should be taken in their application beyond well characterised systems. Given there are no cultured representatives available for probe validation, three FISH probes were designed to target different sites on the ‘Ca. A. nitratireducens’ 16 S rRNA to give higher confidence in their specificity. These included the SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) and SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ) probes. Unlabelled helper probes78 were designed to target the flanking regions of each probe site to increase accessibility to the target site for optimal fluorescent signal (SYMB-1018: H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Helper probes were applied in equimolar amounts with their respective probe. The 5ʹ and 3ʹ ends of the oligonucleotide FISH probes were labelled with the Cy3 fluorophore and were synthesized by Integrated DNA Technologies, Singapore. A higher signal was achieved for these FISH probes with lysozyme pre-treatment of the biomass (0.5 mg ml−1 in 0.05 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, pH 8) for 30 min at room temperature. The Non-EUB nonsense probe was used as a negative hybridization control79. DAPI (1 ng/µl) staining of cells was performed for 15 min in the dark. The labelled biomass was visualized with a Stellaris5 white light laser confocal microscope (Leica, Germany)./p>